« Quay lại

Nghệ An hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm Valydamycin A phòng chống bệnh khô vằn hại lúa

Bệnh khô vằn hại lúa là bệnh nặng thứ hai sau bệnh đạo ôn và là một trong hai bệnh hại quan trọng trên cây ngô. Bệnh có thể gây hại trên nhiều bộ phận của cây lúa như bẹ lá, phiến lá và cổ bông. Khi bệnh nặng, cả bẹ và phần lá phía trên bị chết lụi. Lúa mắc bệnh gây thiệt hại tới năng suất trung bình 15-40%, nhiều nơi gây mất trắng. Trên cây ngô, nấm bệnh có thể gây hại từ khi mới nảy mầm đến khi thu hoạch. Mầm bị nhiễm bệnh, trên rễ mầm và thân mầm thường có những vết bệnh màu nâu. Cây ngô bị nhiễm bệnh trong giai đoạn mầm thường còi cọc và vàng.

Biện pháp phổ biến là sử dụng các sản phẩm hóa học bằng cách phun thuốc kịp thời khi bệnh mới xuất hiện từ 1-2 lần với các loại thuốc cavil 50SC, 50WP, anvil 5SC, lervil 50SC, 75SC, tilt Super 300EC... để hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra. Tuy nhiên, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật đang gây ra tình trạng ô nhiễm môi trường, một số nơi là khá trầm trọng, ảnh hưởng tới hệ sinh thái và sức khỏe của con người. Ở Nghệ An, các sản phẩm phòng trừ bệnh khô vằn chủ yếu là sản phẩm thuốc trừ sâu nhập khẩu chứ chưa thấy sự có mặt của sản phẩm sản xuất từ trong nước. Nhu cầu sử dụng Valydamycin rất lớn mà sản xuất trong nước chưa đáp ứng được. Vì vậy, việc sản xuất Val-A phục vụ nhu cầu của tỉnh với việc làm chủ được nguồn giống, công nghệ với thiết bị lên men và thu hồi trong nước có thể làm giảm giá thành Val-A so với nhập khẩu, quan trọng nhất là tự cung cấp đủ cho tỉnh trong điều kiện dịch bệnh bùng phát. Đây chính là lý do Trung tâm Ứng dụng tiến bộ KH&CN Nghệ An đã phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học, Viện Môi trường Nông nghiệp triển khai thực hiện dự án "Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm Valydamycin A phòng chống bệnh khô vằn từ chủng xạ khuẩn Strep- tomyces hygroscopicus DA15 trong điều kiện Nghệ An".

Trên cơ sở các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước như bột gạo, bột ngô, bột nhộng..., tiến hành nghiên cứu thay thế môi trường nhân giống Gause II và ISP 2 với các hóa chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu nhỏ bằng các môi trường gần với môi trường lên men và rẻ tiền để nhân giống lớn phục vụ sản xuất. Xạ khuẩn được nhân giống trên các môi trường sau: môi trường Gause-II, ISP-2, ISP-4, dung dịch muối A, SP1, 79, A4 và môi trường A9. Xạ khuẩn được nhân giống trên các môi trường lựa chọn, trong điều kiện: lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 300C. Sau 48 giờ, xác định hàm lượng sinh khối tế bào; Chủng xạ khuẩn được giữ giống các dạng khác nhau: bào tử, tế bào sinh dưỡng trong các điều kiện bảo quản khác nhau (thạch nghiêng, đông khô, lạnh sâu...), định kỳ kiểm tra khả năng sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp Val-A để xác định điều kiện bảo quản chủng giống ổn định nhất cho dự án; Xác định hoạt tính kháng sinh: Phương pháp sinh học theo phương pháp cục thạch của Iwasa, 1971; phương pháp khoanh giấy lọc và phương pháp HPLC. Kết quả triển khai đã:

1. Hoàn thiện quy trình nhân giống chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus DA15

Từ các kết quả thí nghiệm, đã xây dựng quy trình nhân giống chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus DA15 như sau:

 

- Sàng lọc các chủng S. hygroscopicus DA15 có khả năng sinh trưởng nhanh:  Chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus  DA15 được lấy từ ống giống nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường Gause II trong thời gian 7 ngày ở nhiệt độ 37°C. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng bề mặt sần sùi, tạo giọt sương trên bề mặt, khuẩn lạc bám chắc vào môi trường, phát triển nhanh từ đĩa môi trường. Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy chuyển sang môi trường tạo bào tử (Môi trường tạo bào tử (g/l) có thành phần gồm Maltose 20; Bột đậu tương 20; Agar 20; nước 1lít; pH 7,0).

- Nhân giống cấp I: Toàn bộ bào tử xạ khuẩn được hình thành trên đĩa sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C được cấy chuyền sang môi trường SP1 đã được khử trùng để nhân giống cấp I. Điều kiện nhân giống cấp 1 được chỉ ra trong bảng 3.1.


 Nhân giống cấp II: Sau khi nhân giống cấp I, mật độ xạ khuẩn đạt yêu cầu, tiến hành cấy truyền sang môi trường nhân giống cấp II. Môi trường nhân giống cấp II là môi trường SP2 (g/l) chứa:  hỗn hợp (20g tinh bột + 20g rỉ đường) và hỗn hợp (2.0g (NH4)2SO4 + 5g bột đậu tương). Các thông số được chỉ ra trong bảng dưới. Giống đạt tiêu chuẩn thì cấy chuyển sang môi trường lên men (bảng 3.1). 

- Bảo quản giống: Giống sau khi được chọn lọc lại từ môi trường Gause II và được nuôi trên môi trường tạo bào tử. Lựa chọn các khuẩn lạc thuần khiết có thể đưa vào bảo quản lại để phục vụ cho quá trình nhân giống sau này, và cho đợt sản xuất tiếp theo. Trong điều kiện ngắn hạn sử dụng phương pháp bảo quản thạch nghiêng trong thời gian tối đa là 3 tháng ở điều kiện 4oC chủng nghiên cứu vẫn đảm bảo được hoạt tính cũng như sinh khối tế bào.  Trong điều kiện dài hạn nên sử dụng bảo quản trong tủ lạnh sâu hoặc bảo quản đông khô để đảm bảo giữ được hoạt tính sinh học của chủng nghiên cứu.

2. Hoàn thiện quy trình sản xuất và thu nhận chất valydamycin A

Hoàn thiện môi trường lên men valydamycin A trên thiết bị lên men lớn: Lựa chọn môi trường lên men phù hợp với điều kiện sản xuất ở bình 500L. Để sử dụng cho sản xuất lớn, cần lựa chọn môi trường lên men rẻ tiền nhưng vẫn đảm bảo sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn tuyển chọn. Kết quả nhận được cho thấy, môi trường MT 5 cho khả năng tích lũy chất kháng sinh (CKS) cao nhất, vì thế được lựa chọn làm môi trường lên men tạo kháng sinh, đồng thời được sử dụng để tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. hygroscopicus DA15.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men: Trên cơ sở MT 5, nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần chính là nguồn cacbon và nitơ: thay đổi nguồn cacbon bột đậu tương, bột ngô cho lên men sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. hygroscopicus DA15. Kết quả tốt nhất thu nhận được là bột đậu tương 20 g/l (HTKS: 18,7 mm; hàm lượng val-A: 6,28 mg/mL; sinh khối ướt: 60,6g/L) và bột ngô 80 g/l (HTKS: 18,6 mm; hàm lượng val-A: 6,68 mg/mL; sinh khối ướt: 74,9 g/L). Với nguồn cao nấm men có khối lượng 10 g/l cho kết quả tốt nhất (HTKS: 18,5 mm; hàm lượng val-A: 6,63 mg/mL; sinh khối ướt: 62,8 g/L).

Ảnh hưởng của yếu tố pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp val-A của chủng S. hygroscopicus DA15: Kết quả sự ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp validamycin của chủng S. hygroscopicus DA15 cho thấy pH môi trường thích hợp là 7,0.

Hoàn thiện quá trình bổ sung các chất vi lượng và chất điều hòa sinh tổng hợp val - A: Vai trò của các chất vi lượng cũng như chất điều hoà sinh trưởng có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của xạ khuẩn trong sự sinh trưởng phát triển của chúng là điều không phủ nhận. Trong điều kiện sản xuất lớn, sử dụng môi trường dinh dưỡng có chứa các chất sẵn có trong tự nhiên như bột ngô, bột gạo,... thì việc hoàn thiện bổ sung các chất vi lượng là cần thiết. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nguyên tố vi lượng: mangan, kẽm, coban, molipden tới sự phát triển của chủng S. hygroscopicus DA15. Kết quả cho thấy: Bổ sung nguyên tố mangan dưới dạng hợp chất MnCl2.4H2O trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thích hợp 3 - 7µg/L; Bổ sung kẽm với lượng 3-5µg/l trong môi trường nuôi cấy giúp chủng nghiên cứu tăng về sinh khối cũng như HTKS và khi bổ sung nguyên tố Coban, sinh khối cũng như HTKS đều thấp hơn so với môi trường ban đầu.

3. Hoàn thiện điều kiện lên men sản xuất Val - A trên thiết bị lên men lớn

Với điều kiện sản xuất val-A trên thiết bị lên men lớn thì việc hoàn thiện các điều kiện lên men là cần thiết, các yếu tố cần quan tâm bao gồm: tỷ lệ tiếp giống, tốc độ khuấy, thời gian lên men, tốc độ thổi khí, nhiệt độ lên men.

Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống, tốc độ khuấy, thời gian lên men: Tỷ lệ tiếp giống: Ở các tỷ lệ giống khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp valydamycin A của chủng S. hygroscopicus DA15 khác nhau. Ở tỷ lệ giống bổ sung 10% thì hàm lượng valydamycin A thu được là cao nhất (6.89 mg/ml). Tốc độ khuấy, thời gian ên men: Thực hiện lên men sản xuất sinh tổng hợp validamycin của chủng S. hygroscopicus DA15 trong bình 500l  với tốc độ khuấy từ 150 - 270 vòng/phút, các điều kiện khác được giữ nguyên như khi lên men ở quy mô (50l). Kết quả cho thấy: từ bình 50 lít khi lên men trên bình 500l thì hiệu suất lên men có thay đổi. Sau 120 giờ lên men trong bình 500 lít, hoạt tính validamycin là 6972 mg/l, trong khi đó ở trong bình 50 lít đạt 6843 mg/ml. Kết quả này cho thấy lựa chọn tốc độ khuấy trộn 180 vòng/phút là thích hợp với thời gian 120 giờ để nâng cao hiệu suất của quá trình lên men.

 Ảnh hưởng của tốc độ thổi khí, nhiệt độ lên men, thời điểm thu hồi kháng sinh: Tốc độ thổi khí: Ảnh hưởng của tốc độ thông khí trong nuôi cấy xạ khuẩn thông qua sự điều chỉnh khí, kết quả nhận được cho thấy, với chế độ thổi khí 1,00 vvm cho hàm lượng validamycin cao nhất đạt trên 6,9 mg/mL (6924 mg/L). Nhiệt độ lên men: Kết quả nhận được từ bảng 3.4 ta thấy, hàm lượng validamycin cao nhất đạt 6872 mg/l không cao hơn nhiều so với 6756 mg/l so với khi lên men không thay đổi nhiệt độ. Quá trinh thay đổi nhiệt độ đã kéo theo sự gia tăng chi phí về nhiệt lượng, khi lên men là không khả thi. Thời điểm thu hồi kháng sinh: Kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khối tế bào đạt cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy (mật độ tế bào đạt 109 CFU/ml), nhưng HTKS đạt trong khoảng 6690 mg/L đến 6780 mg/L sau 108 đến 168 giờ nuôi cấy, cao nhất tại thời điểm 96-120 giờ (4-5 ngày). Điều này được thể hiện rõ trong sơ đồ ở hình 3.6 dưới đây.

4. Hoàn thiện kỹ thuật tách loại sinh khối, thu dịch val - A thô

Hoàn thiện vật liệu sử dụng trong quá trình lọc: Sử dụng giấy lọc và vải lọc thay thế khác nhau, chạy mẫu thử 3 lần lặp, xác định màu sắc, độ đục của dịch lọc, kết quả đều cho thấy sử dụng vải lọc hiệu quả kinh tế hơn. Sử dụng vải lọc và giấy lọc sự khác nhau chủ yếu được thể hiện thông qua độ đục của dịch lọc. Vì vậy sử dụng đo độ đục dịch lọc giúp đánh giá độ tinh khiết của dung dịch và kết quả cho thấy sử dụng giấy lọc mang lại kết quả tốt hơn (bảng 3.3).

Hoàn thiện phương pháp lọc với kỹ thuật sử dụng chất trợ lọc: Để hoàn thiện tách loại sinh khối thu dịch Val - A, dự án đã sử dụng chất trợ lọc, kết quả thu được cho thấy chất trợ lọc diatomite có hiệu quả tốt hơn (độ đục: 6,7 ±0,5; công suất: 99,8 lít/giờ/m2).

5. Hoàn thiện kỹ thuật cô đặc dịch val-A thô, tạo sản phẩm

Ảnh hưởng của áp suất chân không và thời gian giữ nhiệt đến chất lượng sản phẩm: Quá trình cô đặc chân không làm giảm được nhiệt độ sôi của dịch sản phẩm, giảm lượng không khí tồn tại trong thiết bị nên hạn chế phản ứng hóa nâu và hạn chế tổn thất dinh dưỡng trong sản phẩm sau cô đặc.

Nồng độ hàm lượng kháng sinh của sản phẩm: Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng kháng sinh của dịch lọc thay đổi theo áp suất chân không và thời gian cô đặc và cho giá trị cao nhất ở áp suất chân không 650 mmHg trong 15 phút. Giá trị hàm lượng kháng sinh đạt được theo chuẩn của sản phẩm cô đặc ≥ 6500mg/ml). Như vậy, chỉ cần cô đặc dịch lọc sản phẩm ở áp suất chân không 600 mmHg, tránh thời gian gia nhiệt dài hơn và giảm được tổn thất chất kháng sinh.

Hoạt độ nước (aw) của sản phẩm: Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng chất kháng sinh ảnh hưởng rất lớn đến giá trị aw của sản phẩm. Khi nồng độ của dịch lọc cô đặc tăng thì hoạt độ nước có khuynh hướng giảm (aw £0,88) (bảng 1). Giá trị aw ≤ 0,88 là an toàn cho dịch lọc cô đặc.

Độ nhớt của sản phẩm: Độ nhớt của nước được cô đặc tỷ lệ thuận với áp suất chân không và thời gian giữ nhiệt.

Ảnh hưởng của quá trình thanh trùng đến màu sắc và khả năng bảo quản sản phẩm: Khi nhiệt độ thanh trùng tăng, thời gian càng dài thì giá trị thanh trùng (PU) càng lớn, sản phẩm càng an toàn. Với sản phẩm có pH trong khoảng 3,7 - 4,2 thì giá trị 8,385 PU = 5 (Weemaes, 1997) được xem là cần thiết để bảo vệ và duy trì chất lượng tốt. Từ kết quả tính toán cho thấy, thanh trùng ở ≤65oC và giữ nhiệt trong 5 phút cho giá trị thanh trùng 8,385 PU = 9,69, có thể đảm bảo an toàn cho sản phẩm.

6. Đánh giá một số đặc tính hóa lý và sinh học của sản phẩm valydamycin A

Đã nghiên cứu ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến hoạt tính val-A theo thời gian cho thấy: val-A có trong dịch lên men khá bền trong pH 3-5 và ở nhiệt độ 30 - 40°C trong thời gian 3 tháng. Kiểm tra phổ hồng ngoại và sắc kí cho thấy val-A trong dịch lên men khá tương đồng với val-A chuẩn. Hoạt tính val-A trước khi kiểm tra có nồng độ 7.400mg/L. Sau thời gian 6 tháng chế phẩm val-A vẫn duy trì hoạt tính kháng nấm R. Solani kiểm định. Ngoài khả năng đối kháng nấm Rhizoctonia solani, dịch Val A còn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh khác trong nông nghiệp như Collectochitrum sp, Fusarium sp…

7. Hoàn thiện kỹ thuật bảo quản và ổn định các đặc tính của  sản phẩm valydamycin A

Đã chọn được nồng độ các chất phụ gia thực hợp bổ sung vào chế phẩm val-A bao gồm (%): acid citric: 0,3; acid green 25: 0,01 polyethylenglycol: 1,0, inositol 10mM; potadium sorbate 0,03% và  linigsunfonate với lượng 2 %. Chế phẩm val-A sau khi hoàn thiện đã được theo dõi ảnh hưởng theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng đa ổn định trong thời gian 9 tháng.

8. Quy trình sản xuất và thu nhận chất valydamycin A

 

Từ những kết quả đạt được cho thấy, quá trình lên men Streptomycs hygroscopicus DA15 trong bình 500L sản xuất trong nước với môi trường thích hợp bao gồm: ở pH 7, tiếp giống là 10%, ở tốc độ khuấy 180 vòng/phút, tốc độ thổi khí 1.00 (l/l/p), nhiệt độ lên men 370C trong thời gian lên men 120 giờ; Về chỉ tiêu của sản phẩm đạt được như sau: pH 3,0-4,0, màu xanh nâu đặc trưng, nồng độ Val-A = 6743mg/L. Đây là cơ sở quan trọng trong việc giúp người nông dân tiếp cận với các tiến bộ khoa học kỹ thuật, tạo ra sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học mới phòng trừ bệnh khô vằn trên cây nông nghiệp, có thể thay thế cho thuốc hóa học bảo vệ thực vật, rất phù hợp với các mô hình sản xuất nông nghiệp an toàn đang là chủ trương phát triển của nông nghiệp nước ta./.

 

 

 

 

Tin khác

Liên kết website Liên kết website

  Cổng Thông tin điện tử  SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ TỈNH NGHỆ AN


Cơ quan chủ quản: Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Nghệ An. 

Số 75 Nguyễn Thị Minh Khai, TP. Vinh, Nghệ An

Điện thoại: 02383.844500 - Fax: 02383.598478

Email: khcn@khcn.nghean.gov.vn


Cơ quan thiết lập: Trung tâm Thông tin KHCN và Tin học Nghệ An
Số 75A Nguyễn Thị Minh Khai, TP. Vinh, Nghệ An
Điện thoại: 02383.837448 - 02383566380.   Email: webkhcnnghean@gmail.com
Người chịu trách nhiệm: Võ Hải Quang, Giám đốc TT Thông tin KHCN và Tin học Nghệ An
Giấy phép thiết lập số: 23/GP-TTĐT ngày 28/3/2017 do Sở TT&TT Nghệ An cấp

 

 

@ Ghi rõ nguồn ngheandost.gov.vn khi phát hành lại thông tin từ website này.