Hợp tác nghiên cứu áp dụng công nghệ chip ADN chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam, Lào và Campuchia

Thứ hai - 28/11/2022 21:20 0

Lao kháng thuốc, đặc biệt là lao đa kháng (multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB) hiện đang là một trong những thách thức lớn nhất trong kiểm soát bệnh lao. Một trong những hậu quả của điều trị thất bại là các trường hợp kháng thuốc mới sẽ xuất hiện do vi khuẩn phát triển tính kháng thuốc qua quá trình điều trị không thành công hoặc do các ca MRD-TB tiếp tục là nguồn lây của chủng Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc.

Trong quá trình đó, vi khuẩn tiếp tục phát triển tính kháng với các thuốc khác trong phác đồ điều trị, trong đó có các thuốc chống lao hàng hai thiết yếu gây ra bệnh lao siêu kháng thuốc (extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB), thậm chí vi khuẩn có thể phát triển tính kháng với tất cả các thuốc chống lao hiện dùng do điều trị thất bại bệnh nhân phải điều trị nhiều lần với các phác đồ trị liệu khác nhau, gây ra bệnh lao kháng toàn bộ thuốc (total drug-resistant tuberculosis, TDR-TB) và trở nên vô phương cứu chữa. Số lao kháng đa thuốc ước tính khoảng 0,4 - 0,5 triệu ca mỗi năm trên toàn cầu, gồm cả lao mới và lao đã qua điều trị. Số lưu hành lớn gấp 2 đến 3 lần. Khoảng 9,5% số ca MDR-TB là XDR-TB. Đây là tình trạng báo động vì lao kháng thuốc, đặc biệt là MDR-TB và XDR-TB, là những thách thức hàng đầu cản trở các nỗ lực kiểm soát và thanh toán bệnh lao. Tại Việt Nam, ước tính khoảng 1/3 trường hợp mắc lao mới và 1/2 trường hợp lao tái trị có kháng với ít nhất một thuốc chống lao trong phác đồ điều trị đa thuốc hiện sử dụng và có khoảng 1/4 số trường hợp lao tái trị kháng với cùng lúc nhiều thuốc đầu bảng và không thể áp dụng phác đồ chuẩn hiện dùng. Hiện tại, một số công cụ sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện nhanh bệnh lao kháng thuốc được WHO khuyến cáo sử dụng bao gồm GeneXpert MTB/RMP, line probe assay (LPA) và giải trình tự thế hệ mới (NGS). Tuy nhiên, vẫn còn những hạn chế và rào cản trong việc sử dụng các xét nghiệm này. GeneXpert MTB/RMP là một xét nghiệm dựa trên hệ thống vận hành tự động và dễ sử dụng, có thể phát hiện vi khuẩn lao M. tuberculosis và tính kháng rifampicin (RMP) nhưng khả năng xét nghiệm có thể cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả do không nhận biết các đột biến đồng nghĩa cũng như không phát hiện được các đột biến kháng RMP nằm ngoài khu vực điểm nóng đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Ngoài ra, xét nghiệm này cần phải được hỗ trợ bằng các xét nghiệm khác, chẳng hạn như KSĐ, để xác định kiểu hình kháng thuốc đầy đủ của 16 vi khuẩn (kháng với các thuốc khác được sử dụng trongliệu pháp điều trị lao kết hợp 4-5 thuốc). Những hạn chế đáng chú ý khác là chi phí mua sắm, bảo trì hệ thống và sinh phẩm xét nghiệm đắt đỏ, bên cạnh đó, hệ thống dễ bị hỏng hóc và xảy ra sự cố trong điều kiện bảo quản sơ sài của các cơ sở y tế tuyến dưới. LPA đơn giản và dễ thực hiện nhưng số lượng xét nghiệm có kết quả không phiên giải được cao, đồng thời số lượng đột biến liên quan đến tính kháng thuốc mà xét nghiệm có thể phát hiện đươc bị hạn chế. NGS là công nghệ tiên tiến và mạnh nhất hiện nay, nhưng việc áp dụng ở các nước đang phát triển vẫn còn hạn chế do công nghệ phức tạp, máy móc, thiết bị, vật liệu đắt tiền, yêu cầu chuyên môn cao về tin sinh học và cơ sở dữ liệu.

Trước tình hình như vậy, trong khuôn khổ Nhiệm vụ hợp tác Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thư (Chương trình nghị định thư Hoa sen), nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc bằng công nghệ chip ADN và thử nghiệm hiệu quả của bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc, nhóm nghiên cứu Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Bộ Y tế do TS. Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm đã hợp tác với các nhà nghiên cứu Pháp thực hiện đề tài: “Hợp tác nghiên cứu áp dụng công nghệ chip ADN chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam, Lào và Campuchia”. Cho đến nay trên thị trường, vẫn chưa có một kit thương mại nào vừa cho kết quả nhanh vừa có khả năng phát hiện đồng thời nhiều đột biến liên quan đến tính kháng thuốc của nhiều thuốc chống lao như bộ sinh phẩm được phát triển trong nghiên cứu này. Việc áp dụng không đòi hỏi tiêu chuẩn an toàn sinh học cao do không thực hiện trên vi khuẩn lao sống. Do vậy việc sử dụng bộ kit trong chẩn đoán lao kháng thuốc sẽ giúp thúc đẩy tăng cường xét nghiệm, tăng tỷ lệ phát hiện bệnh nhân lao kháng thuốc, góp phần làm giảm tỷ lệ mắc lao kháng thuốc từ đó đóng góp vào sự phát triển kinh tế xã hội.

Sau một thời gian triển khai thực hiện, nhóm đề tài đưa ra kết luận như sau:

1. Đã xây dựng được quy trình chế tạo bộ phẩm chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc bằng công nghệ chip ADN

- Chip ADN là nguyên vật liệu chính trong bộ sinh phẩm chip ADN chẩn đoán lao kháng các thuốc RMP, INH, SM và EMB. Mỗi chip ADN được phủ bằng 216 mẫu dò oligonucleotide, bao gồm 163 mẫu dò đột biến (MT); 52 mẫu dò kiểu dại (WT); và 1 mẫu dò để phát hiện vi khuẩn nhóm Mycobacterium tuberculosis. Panel 216 mẫu dò đã được thiết kế để phục sản xuất chip ADN. Quy trình sản xuất chip đã được xây dựng.

- PCR Mix 1 và PCR Mix 2 là các master mix dùng để thực hiện 2 PCR đa mồi. Các PCR này sử dụng 21 cặp mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại 21 trình tự đích là nơi xảy ra các đột biến gây ra tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn trên các rpoB, katG, inhA và vùng khởi động của gen, rrs, rpsL và embB. Các cặp mồi đã được thiết kế để phục vụ sản xuất các PCR master mix nói trên. Công thức pha các PCR master mix đã được đề xuất.

- DNA chứng dương cho xét nghiệm được tách chiết từ chủng M. tuberculosis phòng thí nghiệm H37Rv. Chứng dương cho phản ứng lai được tổng hợp từ trình tự 18bp của nấm men.

- Công thức pha các nguyên vật liệu cho quá trình lai trình tự ADN đích với mẫu dò, công thức pha dung dịch rửa cũng được nghiên cứu và đề xuất.

- Quy trình PCR đa mồi và quy trình lai được xây dựng và tối ưu hoá.

2. Hiệu quả của bộ sinh phẩm trong chẩn đoán vi khuẩn M. tuberculosis kháng thuốc

- Độ nhạy phân tích của bộ sinh là 2 x 102 vi khuẩn trong một phản ứng PCR, đủ nhạy để thực hiện xét nghiệm tính kháng thuốc trực tiếp trên bệnh phẩm bệnh nhân soi kính dương tính

 - Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm cho chẩn đoán lao (phát hiện M. tuberculosis và phân biệt với chủng NTM) là 100% và 100%

- Với kết quả kháng sinh đồ làm chuẩn, độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trong chẩn đoán kháng RMP là 98,0% và 100%, kháng INH là 93,5% và 100%, kháng SM là 84,7% và 98,4% và kháng EMB là 84,3 % và 89,2%. Mức độ phù hợp giữa kết quả chẩn đoán của bộ sinh phẩm và kết quả KSĐ nuôi cấy đạt mức độ gần như hoàn toàn đối với chẩn đoán kháng RMP và kháng INH, với hệ số phù hợp Kappa tương ứng là 0,97 ± 0,02 và 0,87 ± 0,04 và đạt mức độ phù hợp chặt chẽ đối với chẩn đoán kháng SM và kháng EMB, với hệ số phù hợp Kappa tương ứng là 0,75 ± 0,05 và 0,74 ± 0,05.

- Với kết quả giải trình tự làm chuẩn, độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trong chẩn đoán kháng RMP là 98,7% và 100%, kháng INH là 98,8% và 100%, kháng SM là 98,5% và 100% và kháng EMB là 91,8 % và 98,2%. Mức độ phù hợp giữa kết quả của bộ sinh phẩm với kết quả giải trình tự đạt mức độ gần như hoàn toàn đối với chẩn đoán kháng RMP, kháng INH, SM và EMB, với hệ số phù hợp Kappa tương ứng là 0,98 ± 0,02; 0,98 ± 0,02; 0,98±0,01 và 0,90 ± 0,03.

Bộ sinh phẩm Chip ADN với quy trình thực hiện đơn giản, thời gian thực hiện ngắn 5-8 giờ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán bệnh lao và lao kháng các thuốc lao hàng một RMP, INH, SM và EMB do bao phủ hầu hết các đột biến kháng thuốc tìm thấy trong vi khuẩn gây bệnh lao M. tuberculosis trong khu vực Việt Nam, Campuchia và Lào. Bộ sinh phẩm nên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng và tiến tới thương mại hóa sản phẩm.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 17577/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (TH)

  Ý kiến bạn đọc

Thống kê truy cập
  • Đang truy cập212
  • Hôm nay9,006
  • Tháng hiện tại91,473
Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây